De voortdurende invallen van de Spaanse veroveraar Don Nuño Beltrán de Guzmán in de richting van de westelijke landen van het land, om zijn heerschappij en macht over die gebieden te vergroten, resulteerden in de oprichting van een nieuwe provincie genaamd het Koninkrijk Nieuw Galicië.
De regio werd bewoond door verschillende inheemse groepen, die voortdurend de nederzettingen verwoestten die de Spanjaarden erin hadden gesticht. Nuño de Guzmán's luitenant, kapitein Juan B. de Oñate, kreeg orders om die provincies tot bedaren te brengen en de Villa de Guadalajara te stichten in de plaats genaamd Nochistlán, een feit dat hij voltrok op 5 januari 1532. Gezien de frequente inheemse aanvallen op de stad hij moest een jaar later verhuizen naar Tonalá en later naar Tlacotlán. Een derde overdracht werd gedaan om de stad in de Atemajac-vallei te vestigen, waar de stad definitief werd gesticht op 14 februari 1542 met de aanwezigheid van Cristóbal de Oñate als gouverneur van Nieuw-Galicië en Don Antonio de Mendoza, toen onderkoning van Nieuw-Spanje, die Miguel de Ibarra burgemeester en luitenant-gouverneur benoemde.
De stad ontwikkelde zich snel en begon te concurreren met die van Compostela (tegenwoordig Tepic), dat toen de zetel was van religieuze en burgerlijke machten, zodat de inwoners van Guadalajara zo'n druk uitoefenden op de Audiencia-autoriteiten, dat de koning Felipe II besloot een Cédula van 10 mei 1560 uit te geven om van Compostela naar Guadalajara, de kathedraal, het koninklijk hof en de ambtenaren van de schatkist te verhuizen.
De stedelijke structuur was gepland volgens die van de andere koloniale steden, dus de lay-out werd ontwikkeld in de vorm van een schaakbord van wat het San Fernando-plein was. Later werden de wijken Mexicaltzingo en Analco opgericht door Fray Antonio de Segovia, en de wijk Mezquitán, een van de oudste. De huizen van het stadhuis werden ook gebouwd, voor de huidige tempel van San Agustín en de eerste parochiekerk waar het Paleis van Justitie zich bevindt.
Tegenwoordig vertoont de prachtige stad, rijk aan koloniale gebouwen, een groot aantal relevante architectonische voorbeelden, zoals de kathedraal, een plek die je gezien moet hebben, gebouwd tussen 1561 en 1618 door de architect Martín Casillas. Zijn stijl is geclassificeerd als beginnende barok. De solide structuur verheft zich voor het huidige Plaza de Guadalajara, met zijn merkwaardige torens die, hoewel ze niet tot de oorspronkelijke stijl van het gebouw behoren, momenteel worden erkend als een symbool van de hoofdstad van Guadalajara. De primitieve torens werden in de 19e eeuw verwoest door een aardbeving, daarom zijn de torens van vandaag toegevoegd. Het interieur van de tempel is semi-gotisch van stijl, inclusief de gewelven die van kant zijn gemaakt.
Andere religieuze wijken uit de 16e eeuw zijn het klooster van San Francisco, opgericht in 1542 nabij de rivier, in de wijk Analco, en bijna volledig verwoest tijdens de Reformatie. Zijn tempel, gerenoveerd aan het einde van de 17e eeuw, met zijn barokke façade van bescheiden Solomonische lijnen, is bewaard gebleven. Het klooster van San Agustín, gesticht in 1573 bij koninklijk besluit van Felipe II, behoudt momenteel zijn tempel met zijn gevel van strenge Herreriaanse lijnen en het interieur met geribbelde gewelven.
Santa María de Gracia, een van de andere conventuele fundamenten, werd bewoond door Dominicaanse nonnen uit Puebla, gebouwd in 1590 voor de Plaza de San Agustín en betaald door Hernán Gómez de la Peña. De constructie besloeg zes blokken, hoewel vandaag alleen de tempel bestaat, met een neoklassieke gevel uit de tweede helft van de 18e eeuw.
